การประเมินผลของประสิทธิภาพในยาขี้ผึ้งรักษาบาดแผลแบบใหม่ ด้วยยาขี้ผึ้งแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกที่มีส่วนผสมของน้ำมันจระเข้

อ้างอิงจากการศึกษาในชื่อ EVALUATION OF EFFECTIVENESS IN A NOVEL WOUND HEALING OINTMENT-CROCODILE OIL BURN OINTMENT โดย Hua-Liang Li. และคณะ เผยแพร่ใน Afr J Tradit Complement Altern Med. 2017; 14(1): 62–72.

บทนำ

แผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก เป็นหนึ่งในอาการบาดเจ็บที่พบว่ามีอุบัติการณ์สูงและแพร่หลายโดยทั่วไป และถือเป็นปัญหาทางสาธารณสุขในทั่วโลกจนถึงปัจจุบัน (Bell et al., 1993, Li et al., 2012). อาการบาดเจ็บจากการเผาไหม้อาจนำไปสู่การเกิดอาการแทรกซ้อน อาทิ การไร้ความสามารถหรือพิการเป็นเวลานาน , การรักษาในโรงพยาบาลที่ยาวนานขึ้น,การสูญเสียอวัยวะส่วนปลาย หรือแม้แต่การเสียชีวิต (Upadhyay et al., 2009).

กระบวนการรักษาและซ่อมแซมบาดแผลเป็นกระบวนการที่ต่อเนื่องจากอาการบาดเจ็บต่อผิวหนัง ซึ่งถูกเหนี่ยวนำโดยปฏิกิริยาการอักเสบ ( Inflammatory Response) และเซลล์ใต้ชั้นเดอร์มิส(Dermis) เริ่มกระบวนการสร้างคอลลาเจนมากขึ้น ส่งผลให้เนื้อเยื่อบุผิว (Epithelial tissue) ถูกเสริมสร้างขึ้นใหม่ในเวลาต่อมา (Wilgus, 2008)

ถึงแม้ในปัจจุบันจะมีความก้าวหน้าและพัฒนาที่หลากหลาย อันช่วยให้เรามีความเข้าใจและสนใจในการรักษาอาการบาดเจ็บจากแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกมากขึ้น แต่ยังคงถือเป็นความท้าทายในการรักษาแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกด้วยการรักษาตามแบบแพทย์แผนปัจจุบัน (Li et al., 2012).

ปัจจุบันทั่วโลกมีวิธีการรักษาด้วยการใช้ยาทา (Tropical Therapy) ที่หลากหลายในการรักษาแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก อาทิ ซิลเวอร์ซัลฟาไดอะซีน (Silver sulfadiazine: SSD) ที่ความเข้มข้น 1% (1% Silversalfadiazine : SSD), ยามีโบ ใช้สำหรับการรักษาแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก(Moist Exposed Burn Ointment: MEBO), ครีมซัลฟาไมลอน ที่ความเข้มข้น 10% ใช้ในการยับยั้งการติดเชื้อแบคทีเรียในแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก (10% Mafenide acetate ) และน้ำยาโพวิโดน-ไอโอดีน (Povidone-Iodine) (Hemmila et al., 2010, Jewo et al., 2009, Vloemans et al., 2003). แต่ด้วยวิธีเหล่านี้ยังคงพบเห็นปัญหาในการรักษา ดังตัวอย่างดังต่อไปนี้ การค้นพบว่า ซิลเวอร์ซัลฟาไดอะซีน (SSD) สามารถกระตุ้นอาการอักเสบและก่ออาการบาดเจ็บแก่บาดแผล ต่อต้านการสมานแผล (Li, 2011). อีกทั้งยังพบว่าการรักษาด้วยยามีโบไม่ให้ผลที่คงที่เสมอไป โดยบางบาดแผลแย่ลงในระหว่างการสมานแผล (Huang et al., 2004) อย่างไรก็ตามยังคงมีความจำเป็นและสำคัญอย่างยิ่งที่จะพัฒนายาใหม่สำหรับใช้ในการรักษาแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก

กระบวนการสมานแผลที่ถูกเสริมประสิทธิภาพด้วยการรักษาแบบดั้งเดิม (Traditional Remedies) นั้น โดยส่วนใหญ่อยู่บนพื้นฐานของการใช้แหล่งผลิตจากพืชและสัตว์ (De Oliveira et al., 2010, Li et al., 2012, Süntar et al., 2011, Sun et al., 2015, Tumen et al., 2011).

การแพทย์แผนโบราณของจีน(Traditional Chinese Medicine) เป็นสิ่งที่สามารถนำเสนอถึงความสำคัญและแหล่งผลิตที่มีประสิทธิผลต่อการค้นหายาแบบใหม่ ในขณะที่ผลข้างเคียงจากส่วนประกอบที่ใช้ในการแพทย์แผนจีนเขตร้อน นั้นพบได้น้อยมาก (Li et al., 2011) นอกจากนี้ การศึกษาวิจัยที่เพิ่มมากขึ้นได้แสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพและ การออกฤทธิ์ทางเภสัชวิทยา(Pharmacology Activity) ของการแพทย์แผนโบราณของจีน (Fan et al., 2010, Li et al., 2011, Xutian et al., 2009, Zhang et al., 2013).

จระเข้(Crocodile)เป็นชื่อเรียกทั่วไปของสัตว์เลื้อยคลานในวงศ์ Crocodyliae (Buchanan, 2009) จระเข้น้ำจืดสายพันธุ์ไทย (Crocodylus Siamnensis) เป็นสายพันธุ์หนึ่งของจระเข้น้ำจืดที่มีถิ่นกำเนิดและกระจายตัวอยู่ในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ (Kang et al., 2012) ซึ่งในปัจจุบันนั้นมีการเติบโตอย่างกว้างขวางในประเทศไทยและในมณฑลกวางตุ้งหรือมณฑลกว่างตง(Guangdong province) สาธารณรัฐประชาชนจีน

น้ำมันจระเข้สกัดจากเนื้อเยื่อไขมันของจระเข้ ประกอบไปด้วยกรดไขมันอิ่มตัวและไม่อิ่มตัวในความเข้มข้นสูง น้ำมันจระเข้ถูกบันทึกว่ามีประสิทธิภาพในการรักษาอาการเจ็บป่วย ตั้งแต่อาการทางผิวหนังจนถึงมะเร็ง และถูกใช้มาเป็นเวลายาวนานหลายร้อยปีโดยแพทย์แผนโบราณ (Buthelezi et al., 2012)

ในประเทศเม็กซิโก น้ำมันถูกใช้ในการรักษาอาการเจ็บไข้ได้ป่วย อาทิ โรคหืด(Asthma),อาการผิดปกติในปอด ถุงลมโป่งพองขาดความยืดหยุ่น(Emphysema) และโรคไข้หวัดใหญ่ (Influenza) (Buthelezi et al., 2012, De Villiers and Ledwaba, 2003, Lindsey, 1999). โดยน้ำมันจระเข้และผลิตภัณฑ์จากน้ำมันจระเข้ถูกใช้ในลักษณะของยาขี้ผึ้งสำหรับแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกในการแพทย์แผนโบราณ อาทิ การแพทย์แผนโบราณของจีนและการแพทย์แผนโบราณในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ (Li et al., 2012, Tang, 2007). และนอกจากนี้ยังมีการศึกษาที่พบว่าน้ำมันจระเข้สามารถเร่งกระบวนการสมานแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกบนผิวหนังและลดอัตราการเกิดรอยแผลเป็นในหนูทดลอง  (Li et al., 2012).

เป้าหมายในการศึกษานี้เพื่อพัฒนายาที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น ไม่เพียงแต่การใช้จุดเด่นของน้ำมันจระเข้ต่อการสมานแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก แต่ยังมีจุดเด่นสำคัญในฤทธิ์ลดอาการปวด(Antinociceptive) และต้านอาการอักเสบ(Anti-inflammatory) 

ยาขี้ผึ้งแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกที่มีส่วนผสมของน้ำมันจระเข้ (Crocodile oil burn ointment: COBO) เป็นยาทาในทางแพทย์สมุนไพรแผนจีน(Topical Chinese Herbal Medicine) ส่วนประกอบจากแร่ธาตุธรรมชาติ,น้ำมันจระเข้ และสารสกัดจากสมุนไพร 5 ชนิด สูตรและวิธีการเตรียม ยาขี้ผึ้งแผลไฟไหม้ที่มีส่วนผสมของน้ำมันจระเข้ ได้รับอนุญาตจาก National Patent Office แห่งสาธารณรัฐประชาชนจีน จากประสบการณ์ก่อนหน้าของคณะผู้ทำการศึกษาได้แสดงถึงผลลัพธ์ที่ดีต่อการรักษาในอาการบาดเจ็บจากแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก (Chen et al., 2011). เป้าประสงค์ของการศึกษาปัจจุบันนี้เพื่อประเมินศักยภาพในการรักษาของตำรับยานี้ด้วยการใช้สัตว์ทดลอง 

วัสดุอุปกรณ์และวิธีการทดลอง (Material and Methods)

น้ำมันจระเข้(crocodile oil) สกัดจากไขมันตามวิธีการที่ใช้ก่อนหน้า(Li et.al.,2012) มีความเข้มข้นสูง ประกอบด้วยกรดไขมันปาล์มมิติก, กรดไขมันโอเลอิก และกรดไขมันไลโนเลอิกในปริมาณมาก 

ยาขี้ผึ้งแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกที่มีส่วนผสมของน้ำมันจระเข้ หรือ COBO ถูกทำขึ้นตามสูตรการแพทย์แผนจีน ด้วยการใช้น้ำมันจระเข้ร่วมกับสารสกัดจากพืชสมุนไพรจีนที่ใช้ ได้แก่ รากแห้งของ  Arnebia euchroma I.M.Johnst., รากแห้งของ Astragalus membranaceu Moench, รากแห้งของ Savia miltiorrhiza Bunge ,รากแห้งของ Sanguisorba officinalis L. และ Borneolum syntheticum หรือพิมเสนสังเคราะห์ (Chan et.,al 2012) ส่วนประกอบดังกล่าวทำการจัดซื้อจาก โรงพยาบาลในเครือ (First Affiliated Hospital) ทั้งนี้สมุนไพรที่ใช้ได้รับการบ่งชี้โดยนักพฤษศาสตร์ผู้มีคุณวุฒิ มีการใช้น้ำมันงา(Sesame oil) และเอธานอล เป็นตัวสกัดสาร และใช้อัลโบลีน (Albolene)เป็นเบส 

การเตรียม COBO หรือ ยาขี้ผึ้งแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกที่มีส่วนผสมของน้ำมันจระเข้ เลือกวิธีการสกัดด้วยอุณหภูมิต่ำภายใต้สภาวะสุญญากาศ (Low-Temperature vacuum extraction)  ที่สามารถให้ทั้งสารที่ละลายในน้ำและไขมันอยู่ในสารสกัดที่ใช้ ขั้นตอนทั้งหมด กระทำในสภาวะปลอดเชื้อ เริ่มด้วยการนำส่วนประกอบจากพืชสมุนไพร Arnebia euchroma I.M.Johnst. จำนวน 20 กรัม, Astragalus membranaceu Moench จำนวน 10 กรัม, Savia miltiorrhiza Bunge จำนวน 10 กรัม , Sanguisorba officinalis L. จำนวน 10 กรัม และ และ Borneolum syntheticum จำนวน 20 กรัม ตามลำดับ ไปทำการสกัดด้วยน้ำมันงา(Sesame oil) 500 ml และ เอธานอล 500 ml ในเครื่องกลั่นระเหยสารแบบหมุน (Rotary Evaporator) ที่อุณหภูมิ 40-50 °C ประมาณ 4-6 ชั่วโมง ในส่วนของขั้นตอนการสกัดจะผสมทุกส่วนให้เข้ากันจนกระทั่งไม่มีเอธานอลหลงเหลืออยู่ จากนั้นนำไปปั่นแยกด้วยเครื่องปั่นเหวี่ยง(Centrifuge) ที่ความเร็ว 3000ppm 

อัลโบลีน (albolene) ถูกนำไปอุ่นร้อนให้อยู่ในรูปของเหลว ผสมเข้ากับสารสกัดจากพืชสมุนไพรที่ผ่านการกรองแล้ว และน้ำมันจระเข้ ในอัตราส่วน 2:1:1 จากนั้นเก็บรักษาในบรรจุภัณฑ์ปลอดเชื้อและสภาพแวดล้อมที่สะอาด ยาขี้ผึ้งแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกที่มีส่วนผสมของน้ำมันจระเข้ (COBO) ได้รับการบ่งชี้ด้วยวิธีการทาง Gas-Chromatography-mass Spectrometry(CG-MS) และประกอบด้วยพิมเสนที่ปริมาณขั้นต่ำอย่างน้อย 6% ของน้ำหนักรวม สูตรและขั้นตอนการเตรียมดังกล่าวได้ยื่นขออนุญาตจดทรัพย์สินทางปัญญา ประเภท Invention patents ในสาธารณรัฐประชาชนจีน หมายเลข ZL201010505834.X

การตรวจสอบฤทธิ์ทางชีวภาพ (Biological activity tests)

สัตว์ทดลอง(animals) หนูขาวเพศผู้พันธุ์วิสตาร์ (200±20g) และ หนูเมาส์เพศผู้ (20±2g) ถูกควบคุมอยู่ในสภาวะ กลางวัน 12 ชั่วโมง และ กลางคืน 12 ชั่วโมง ภายใต้ช่วงอุณหภูมิ 21-22 °C และความชื้น 60-65% ให้น้ำและอาหารแบบไม่จำกัด โดยตลอดการศึกษา ปฏิบัติตามแนวทางปฏิบัติ จรรยาบรรณการใช้สัตว์ทดลอง โดยศูนย์สัตว์ทดลอง 

การทดลองแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก (Burn Experiments)

อาการบาดเจ็บจากแผลไฟไหม้ น้ำร้อนลวก (Burn injury) 

การทดลองนี้กระทำในศูนย์สัตว์ทดลอง หนูทดลองถูกนำไปปรับตัวให้ชินกับสภาพแวดล้อมเป็นเวลา 1 อาทิตย์ล่วงหน้าก่อนเริ่มทำการทดลอง โดยสามารถเข้าถึงแหล่งน้ำและอาหารได้แบบไม่จำกัดเวลา 

เส้นขนบริเวณส่วนหลังหนูทดลองถูกกำจัดออกด้วยสารละลาย 10% โซเดียมซัลไฟด์ ในเวลา 24ชม. ก่อนเริ่มทำการทดลองแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก แอลกอฮอลล์ 70% ถูกใช้เพื่อทำการฆ่าเชื้อผิวหนังบริเวณส่วนหลัง กำหนดแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกระดับสองให้มีขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 2.5cm ด้วยการใช้น้ำบรรจุเต็มแก้วขนาด 40กรัม ที่ถูกต้มในน้ำร้อนที่อุณหภูมิ 100 °C เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นเทตั้งฉากใส่บริเวณผิวหนังที่ถูกกำจัดขนด้านหนึ่ง อาศัยตามแรงโน้มถ่วงโลก ไม่ใช้แรงกดดัน เป็นระยะเวลา 10 วินาที(Lee et.al.,2011, Lt et al., 2012) ในหนูทดลองแต่ละตัว แผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกถูกกระทำขึ้นที่บริเวณหลัง 2 ตำแหน่ง ยกเว้นในกลุ่มหลอก (Sham Group) 

การทดลองกับสัตว์(Experimental Protocol) 

หนูเมาส์คุณภาพความปลอดเชื้อจำเพาะ (specific pathogen free, SPF) จำนวน 24 ตัว ถูกแบ่งเป็น 4 กลุ่มในจำนวนเท่าๆกัน โดยใช้ตารางเลขสุ่ม(random number table) นำใส่ในกรงขังแยก หลังการทดลองแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก โดยทั้ง 4 กลุ่มทำการกำหนดดังนี้ กลุ่มหลอก หรือ sham group, กลุ่มควบคุม หรือ burn control group ทำการรักษาด้วยน้ำเกลือ (saline solution) : แผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก 12 ตำแหน่งในหนูทดลอง 6 ตัว ใช้อ้างอิงเป็น negative control, กลุ่มที่ทำการรักษาด้วยซิลเวอร์ซัลฟาไดอาซีน (SSD): แผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก 12 ตำแหน่งในหนูทดลอง 6 ตัว ใช้อ้างอิงเป็น Positive Control และกลุ่มที่ทำการรักษาด้วยยาขี้ผึ้งแผลไฟไหม้ที่มีส่วนผสมของน้ำมันจระเข้ (COBO) : แผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก 12 ตำแหน่งในหนูทดลอง 6 ตัว ครีมซิลเวอร์ซัลฟาไดอาซีน (Silver sulfadiazine) ที่ความเข้มข้น 1% wt/wt ทำการสั่งซื้อจากโรงพยาบาลในเครือ และใช้เป็นมาตรฐานในการดูแล(Standard Care)  

ใช้ SSD หรือ COBO ปริมาณ 0.3g ทาลงบริเวณแผลเบาๆและให้เลยบริเวณขอบแผลออกมาเล็กน้อยเพื่อให้มั่นใจว่าครอบคลุมทั่วทั้งบริเวณแผล การรักษาจะทำซ้ำวันละ 2 ครั้งเป็นเวลา 28 วัน  ทำการถ่ายภาพบริเวณแผลผ่านกล้องด้วยเลนส์ออพติคัล ในระยะห่างและองศามุมที่เหมาะสมตลอดระยะเวลาที่ 3,7,10,14,21 และ 28 วัน  

ทำการสังเกตการณ์ในเรื่อง การหดตัวของบาดแผล (Wound Contraction) , ระยะเวลาในการปิดแผล (Wound Closure Time), อาการบวมน้ำ(Edema) และการไหลซึมของเหลว (Exudation) รวมถึงความแข็งที่บริเวณพื้นผิวของบาดแผล (Wound Surface) คำนวณจากการติดตามเค้าโครงรูปร่างด้วยกระดาษโปร่งใส(Transparent Paper) เพื่อประเมินผลการหดตัวของบาดแผล(Wound Contraction) (Feng et al. 2010) 

ในวันที่ 28 ที่การทดลองสิ้นสุด หนูทดลองถูกการุณยฆาตด้วยการใช้ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ ในส่วนของเนื้อเยื่อแกรนูเลชัน (Granulation Tissue) หรือ เนื้อเยื่อที่เกิดขึ้นใหม่ทดแทนเนื้อเยื่อที่เสียไป ได้ถูกตัดออกเพื่อใช้ศึกษาทางด้านเนื้อเยื่อ (Histological Examination) เพื่อหาคำตอบถึงวงจรการผลัดเปลี่ยนโครงสร้างผิว ในช่วง 28 วันหลังเกิดแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก ทำการตัดผ่านทางขวางผ่านแนวยาวบริเวณที่เกิดรอยแผลเป็น ตัดแบ่งออกเป็นส่วนๆที่ความหนา 5 µm และย้อมสีด้วยสี ฮีมาทอกซีลิน (Hematoxylin) และ อีโอซิน (Eosin) ประเมินตัวอย่างชิ้นเนื้อในด้านการเปลี่ยนแปลงทางเนื้อเยื่อ ขอบเขตกระบวนการสร้างชั้นเซลล์ผิวใหม่ (re-epithelialization) การเจริญเติบโตเต็มที่และการจัดเรียงตัวของเนื้อเยื่อบุผิวที่ชั้นเอพิเดอร์มิส หรือชั้นหนังกำพร้า,ระดับของการพัฒนา เนื้อเยื่อแกรนูเลชัน(Granulation Tissue),ระยะห่างระหว่างชั้นเอพิเดอร์มิสและชั้นเดอร์มิส และส่วนของโครงสร้างในรูขุมขน ใช้เครื่องตัดชิ้นเนื้อ ตัดแนวขวางตัวอย่างชิ้นเนื้อผิว ที่ความหนา 8 µm ใช้เทคนิคการย้อมสีด้วย Tetrachrome Stain Sacpic (Nixon,1993) ซึ่งเป็นเทคนิคในการย้อมสีเพื่อดูลักษณะของรูขุมขน (Hair Follicle) และประเมินจำนวนรวมของรูขุมขนหรือรูขุมขนที่ยังคงดำเนินกิจกรรมอยู่(Active Follicle) ซึ่งจะติดสีแดง ,รูขุมขนปฐมภูมิ และรูขุมขนทุติยภูมิ ตามลำดับ ทำการวัดค่าโดยประเมินผลจากจำนวนเฉลี่ยของรูขุมขนที่กำลังขยายสูง 20X ตรงกลางตัวอย่างชิ้นเนื้อเยื่อแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวก

การทดสอบฤทธิ์แก้ปวดด้วยการใช้กรดอะซิติกกระตุ้นอาการชักดิ้นชักงอในหนูทดลอง(Acetic-Acid-induced writhing response in mice)

หนูไมซ์(mice) จำนวน 40 ตัว ถูกสุ่มและแบ่งเป็น 5 กลุ่มเท่าๆกัน ดังนี้ กลุ่มสารละลายน้ำเกลือ(saline Solution Group) หรือ negative Control 0.3g/20g , กลุ่มยามีโบ (MEBO group) หรือ positive control 0.3g/20g , และกลุ่มยาขี้ผึ้งแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกที่มีส่วนผสมของน้ำมันจระเข้ (COBO) แบ่งแยกย่อยออกเป็น 3 กลุ่มย่อยตามระดับขนาดยา ได้แก่ ระดับต่ำ(Low Doses Group) 0.05g/20g , ระดับกลาง(Middle Doses Group ) 0.3/20g และระดับสูง(High Doses Group) 0.6g/20g ตามลำดับ

การทดลองกระทำตามเทคนิคที่ได้ชี้แจงก่อนหน้า(Zhou et al.,2008) หนูไมซ์ถูกฉีดกรดอะซิติกเข้มข้น 0.6% ในสารละลายน้ำเกลือ (saline solution) ที่ปริมาณ 0.1ml/10g ต่อน้ำหนักตัว เข้าที่บริเวณช่องท้อง (intraperitoneal) ทำการประเมินความถี่ของอาการชักดิ้นชักงอในช่วง 20 นาทีหลังฉีด และระยะเวลาที่ปรากฏอาการชักดิ้นชักงอครั้งแรก หลังสิ้นสุดการทดลอง สัตว์ทดลองถูกการุณยฆาตด้วยการใช้ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์

การทดสอบฤทธิ์ต้านอาการอักเสบ ด้วยการใช้ไซลีนกระตุ้นอาการใบหูบวมในหนูทดลอง (Xylene-induced ear swelling in mice)

หนูไมซ์(mice) ถูกสุ่มและแบ่งเป็น 5 กลุ่มๆละ 8 ตัวเท่าๆกัน ทำการทดลองโดยใช้ยาขี้ผึ้งแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกที่มีส่วนผสมของน้ำมันจระเข้ (COBO) ในขนาดยาที่แตกต่างกัน ได้แก่ 0.05g/20g,0.3g/20g และ 0.6g/20g ยามีโบ(MEBO) ถูกใช้ในกลุ่มควบคุมแบบบวก หรือ positive control และสารละลายน้ำเกลือ(saline solution) ถูกใช้ในกลุ่มควบคุมแบบลบ หรือ negative control โดยทั้งสองกลุ่มใช้ระดับขนาดยาที่ 0.3g/20g

การทดลองกระทำตามเทคนิคที่ได้ชี้แจงก่อนหน้า(Kou et al., 2005) ในการเริ่มต้นการทดลอง หนูทดลองแต่ละตัวจะได้รับ ไซลีนที่ปริมาณ 50µl ในบริเวณผิวด้านหน้าและด้านหลังของใบหูข้างขวา ส่วนใบหูข้างซ้ายใช้เป็นกลุ่มควบคุม(control) ใน 30นาทีต่อมา จึงทายาขี้ผึ้งแผลไฟไหม้น้ำร้อนลวกที่มีส่วนผสมของน้ำมันจระเข้ (COBO) เข้าที่บริเวณใบหูขวา ใน 2 ชั่วโมงต่อมาหนูทดลองจะถูกดึงคอ (Cervical dislocation) ซึ่งเป็นวิธีที่เหนี่ยวนำให้สัตว์หมดความรู้สึกตัวอย่างรวดเร็วโดยที่ไม่มีการ ตกค้างของยาหรือสารเคมีที่อาจไปรบกวนเนื้อเยื่อของสัตว์ และใช้ใบหูทั้งสองข้างเป็นตัวอย่างในการศึกษา ถูกตัดเป็นส่วนวงกลมด้วยที่เจาะจุกก๊อก (cork borer) ในขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 8 มม.และนำไปชั่งน้ำหนัก ระดับของใบหูที่บวมถูกคำนวณโดยใช้น้ำหนักของใบหูซ้ายที่ไม่ได้รับไซลีนเป็นพื้นฐาน  หลังสิ้นสุดการทดลอง สัตว์ทดลองถูกการุณยฆาตด้วยการใช้ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์

การวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติ (Statistical analysis)

ข้อมูลที่ได้รายงานเป็น mean±SE คือ ค่าเฉลี่ย(mean) และตามด้วย ค่าผิดพลาด (SE: Standard deviation หรือ Standard error of the mean อย่างใดอย่างหนึ่ง) นัยสำคัญทางสถิติ (Statistical significance) ระหว่าง กลุ่มทดลอง(Experimental) กับ กลุ่มควบคุม(Control) ทำการวิเคราะห์โดยใช้ ANOVA ด้วย Dunnett’s Test โดยใช้ Graph Pad Prism 2.01(Graph Pad Software Inc.) ค่า P-value <0.05 ใช้เพื่อการพิจารณานัยสำคัญทางสถิติ ค่า Morphometric Parameter วิเคราะห์ด้วยเครื่องวิเคราะห์ภาพ Olympus Microscope BX61 โดยใช้โปรแกรมวิเคราะห์ภาพด้วยคอมพิวเตอร์ (Image Analyzing Computer Program) รุ่น Image-Pro Plus 6.2